Bestimmung von Ethanol mittels Enzymatik mit zwei Enzymen (Alkoholdehydrogenase + Aldehyddehydrogenase) bei Proben mit niedrigem Ethanolgehalt.
Geeignet für Biere, alkoholfreie Biere, alkoholreduzierte Biere, Biermischgetränke, AFG, Säfte, Getränke.
Ethanol wird durch Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid (NAD+) in Gegenwart des Enzyms Alkohol-Dehydrogenase (ADH) zu Acetaldehyd oxidiert:
\(\text{Ethanol + NAD}^+ \space ^{\underrightarrow{\text{ADH}}} \space \text{Acetaldehyd + NADH + H}^+\)
Das Gleichgewicht dieser Reaktion liegt auf der Seite von Ethanol und NAD. Durch alkalisches Milieu und durch Abfangen des gebildeten Acetaldehyds kann das Gleichgewicht auf die rechte Seite verschoben werden. Acetaldehyd wird in Gegenwart von Aldehyd-Dehydrogenase (AI-DH) quantitativ zu Essigsäure oxidiert:
\(\text{Acetaldehyd+ NAD}^+ \space ^{\underrightarrow{\text{Al-DH}}} \space \text{Essigsäure + NADH + H}^+\)
Die bei den Reaktionen gebildete NADH-Menge ist der halben Ethanolmenge äquivalent und wird aufgrund seiner Absorption bei 340 nm photometrisch bestimmt.
Spezifität der Bestimmung [1]
Der Einfluss von Aldehyden und Ketonen wird durch die Reihenfolge der Reagenzienzugabe beim Test ausgeschaltet. Methanol wird wegen ungünstiger KM-Werte (Michaelis-Menten-Konstante) der verwendeten Enzyme nicht umgesetzt.
n-Propanol und n-Butanol werden unter Testbedingungen quantitativ umgesetzt, höhere primäre Alkohole führen zu probeabhängigen Schleichreaktionen. Sekundäre, tertiäre und aromatische Alkohole reagieren nicht. Glycerin stört den Test auch bei höheren Konzentrationen nicht.
Bestimmung des Nitratgehaltes in Würz, Bier und anderen Getränken sowie von Malz und Hopfen
Die Methode eignet sich für Würze, Bier und andere Getränke sowie für Malz und Hopfen
Der Nitratgehalt des Bieres wird im Wesentlichen vom Nitratgehalt des Brauwassers und des Hopfens (Doldenhopfen, Hopfenpulver) bestimmt. Eine Reduktion von Nitrat zu Nitrit durch die Hefe konnte in keinem Stadium des Brauprozesses nachgewiesen werden.
Nitrat wird durch reduziertes Nicotinamid-Adenin-Dinucleotidphosphat (NADPH) in Gegenwart des Enzyms Nitrat-Reductase (NR) zu Nitrit reduziert [1].
Die bei dieser Reaktion verbrauchte NADPH-Menge ist der Nitratmenge proportional. NADPH ist Messgröße und aufgrund seiner Absorption bei 334, 340 oder 365 nm zu bestimmen.
Bestimmung von L-Milchsäure/D-Milchsäure mittels Enzymatik
Geeignet für Malz, Würze, Biere, Biermischgetränke und alkoholfreie Getränke
Fruchtsäfte
Die positive Wirkung von Fermentationsgetränken auf den menschlichen Körper ist schon seit Jahrhunderten bekannt. So können die Kultgetränke Kwas (Russland) und Kombucha (Asien) auf eine lange Geschichte zurückblicken und wurden seit jeher als heilendes Getränk konsumiert. Bei der alkoholfreien Fermentation werden Mikroorganismen wie z. B. Milch- und Essigsäurebakterien verwendet. Dabei entstehen organische Säuren wie Milchsäure oder Gluconsäure, die die Verdauung und den Stoffwechsel fördern. Insbesondere aufgrund ihres leicht säuerlichen Geschmacks sind Fermentationsgetränke bei den Verbrauchern als gesunde natürliche Erfrischung beliebt.
Als Basis für Fermentationsgetränke dienen Malz, Fruchtsaft und Tee.
In der Regel enthalten Fermentationsgetränke 0,5 – 15 g/l D-Gluconsäure.
Malz, Würze und Bier
L- und D-Milchsäure entstehen bei der Gärung bzw. sind teilweise im Malz und in der Würze vorgebildet. Der Milchsäuregehalt wird durch biologische Säuerung der Würze oder Verwendung von Sauermalz angehoben.
L-Milchsäure (L-Lactat) wird durch Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid (NAD) in Gegenwart von L-Lactat-Dehydrogenase (L-LDH) zu Pyruvat oxidiert. Zur Oxidation von D-Milchsäure benötigt man das Enzym D-Lactat- Dehydrogenase (D-LDH):
Das Gleichgewicht dieser Reaktionen liegt weitgehend auf der Seite von Lactat. Es kann jedoch durch Abfangen des Pyruvats mit Hilfe der nachgeschalteten Reaktion mit dem Enzym Glutamat-Pyruvat-Transaminase (GPT) in Gegenwart von L-Glutamat auf die Seite von Pyruvat und NADH verschoben werden:
Die während der Reaktionen gebildete NADH-Menge ist der L-Milchsäure- bzw. D-Milchsäure-Menge äquivalent und wird aufgrund seiner Absorption bei 334, 340 oder 365 nm photometrisch bestimmt.
Bestimmung von Oxalsäure mittels Enzymatik
Geeignet für Malz, Würze, Biere, Biermischgetränke und alkoholfreie Getränke
Oxalsäure stammt vorwiegend aus dem verwendeten Malz. Durch Umsetzung mit den Calciumionen des Brauwassers können Trübungen von Calciumoxalat entstehen. Ebenso sind diese Kristalle Kondensationskeime für das spontane Entbinden von Kohlensäure (Gushing). Die exakte Bestimmung von Oxalsäure ist deshalb für die Brauereitechnologie von großer Bedeutung.
Oxalsäure (Oxalat) wird in der durch das Enzym Oxalatoxidase zu Kohlendioxid und Wasserstoffperoxid oxidiert.
In Gegenwart des Enzyms Peroxisase (POD) reagiert Wasserstoffperoxid mit MTBH (3-Methyl-2-Benzo-Thiazolinon-Hydrazon) und DMAB (3-Dimethyl-Amino-Benzoesäure zu einem blauen Quinon-Komplex.
Die Intensität der Farbe ist proportional zur Konzentration des Oxalats in der Probe und wird bei 590 nm gemessen.
Bestimmung von Ascorbinsäure mittels Enzymatik
Geeignet für Würze, Biere, Biermischgetränke und AFG
L‑Ascorbinsäure (L‑Ascorbat) sowie weitere reduzierende Substanzen (X‑H2) reduzieren das Tetrazoliumsalz MTT [3-(4,5-Dimethylthiazolyl-2)-2,5- Diphenyltetrazoliumbromid] in Gegenwart des Elektronenüberträgers PMS (5-Methylphenaziniummethosulfat) bei pH = 3,5 zu einem Formazan:
In einem Probenleerwert-Ansatz wird von allen reduzierenden Substanzen nur der L‑Ascorbatanteil in der Probe durch Ascorbatoxidase (AAO) in Gegenwart von Sauerstoff oxidativ entfernt. Dabei entsteht Dehydroascorbat, das mit MTT/PMS nicht reagiert:
Die Extinktionsdifferenz der Probe abzüglich der Extinktionsdifferenz des Probenleerwertes ist der L‑Ascorbatmenge in der Probe äquivalent. Das MTT-Formazan ist Messgröße und wird aufgrund seiner Absorption im sichtbaren Bereich bei 578 nm photometrisch bestimmt.
Bestimmung von Glycerin mittels Enzymatik
Geeignet für Würze, Biere, Biermischgetränke und alkoholfreie Getränke
Glycerin entsteht während der Gärung. Glycerin wird in der durch Glycerokinase (GK) katalysierten Reaktion mit Adenosin-5'-triphosphat (ATP) zu L‑Glycerin-3-phosphat phosphoryliert:
Mittels Pyruvat-Kinase (PK) wird das entstandene Adenosin-5'-diphosphat (ADP) durch Phosphoenolpyruvat (PEP) unter Bildung von Pyruvat wieder in ATP überführt:
Pyruvat wird durch reduziertes Nicotinamid-adenin-dinucleotid (NADH) in Gegenwart des Enzyms L-Lactat-Dehydrogenase (L-LDH) zu L-Lactat hydriert, wobei NADH zu NAD oxidiert wird:
Die während der Reaktion verbrauchte NADH-Menge ist der Glycerinmenge äquivalent. NADH ist Messgröße und aufgrund seiner Absorption bei 334, 340 oder 365 nm zu bestimmen.